แม้ว่าเฟลมมิงจะยุติการศึกษาเพนิซิลลินในปี 2474 แต่การศึกษาของเพนิซิลลินเสร็จสิ้นโดย Howard Florey และ Ernest Chain นักวิจัยสองคนของมหาวิทยาลัยอ็อกซ์ฟอร์ด จากนั้นในปี 1940 ด้วยความช่วยเหลือจาก Norman Heatley ผู้ซึ่งสามารถสกัดเพนิซิลลินจากการกรองปริมาณมากจากถังหมัก Florey สามารถทำการทดลองที่สำคัญเกี่ยวกับเพนิซิลลินได้ เพนิซิลลิน การทดลองแสดงให้เห็นว่าเพนิซิลลินทดลองซึ่งผลิตขึ้นจากกระบวนการผลิตและการทำให้บริสุทธิ์นั้นมีศักยภาพเพียงพอในการปกป้องสิ่งมีชีวิตจากสเตรปโตคอกคัส แบคทีเรียชนิดหนึ่ง สิ่งนี้สำเร็จได้เนื่องจากการทดลองให้หนู 8 ตัวฉีด Streptococcus จากนั้นให้หนู 4 ตัวฉีดเพนิซิลลิน ส่วนอีก 4 ตัวที่เหลือเป็นชุดควบคุม หนูที่ถูกทิ้งให้ควบคุมตายทั้งหมด แต่สี่ตัวที่รักษาด้วยเพนิซิลลินรอดชีวิต